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HPLC분석관련
Chiral column 의 신속 Method 개발 방법
광학이성질체 분석에서 분취정제
: 고순도의 광학이성질체를 분리정제하기 위해서는 크로마토그래피가 효과적인 방법입니다. 하지만 분취정제를 하기 전에 분리조건을 찾고 최적화하는 메서드 스카우팅(Method scouting) 부분은 매우 시간이 오래 걸리는 공정이기도 합니다.
따라서 메서드 스카우팅을 신속하게 수행하게 되면 시간 절약과 더불어 효율이 좋은 광학 활성체를 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 즉, 의약품 연구 개발의 시간 절약이 될 수 있는 방법이기도 합니다.
Chiral (키랄) 분리 메서드 스카우팅
메서드 스카우팅은 다음과 같은 과정을 거쳐 진행될 수 있습니다.
광학이성질체를 컬럼별로 진행하고 이동상을 선정합니다. 분리모드는 보통 3가지를 선택할 수 있지만 순상이 가장 많이 사용됩니다. 기본조건이 선정되면 분리조건 최적화를 통해 결과를 도출할 수 있습니다.
먼저 가장 많이 사용되는 순상HPLC를 이용하여 메서드 스카우팅을 해보도록 하겠습니다.
컬럼별로 일단 n-hexane과 2-propanol, n-hexane과 ethanol의 조합을 통해 분리를 확인하고 두번째로 다른 용매를 선정합니다. 최초에는 기울기용리(Gradient)방식으로 진행한 후 isocratic 조건을 검토합니다. 용매와 기울기 여부가 정해지면 첨가제와 기타 조건을 최적화 합니다.
순상 HPLC 스카우팅 사례 – 아스타잔틴 (Astaxanthin)
새우나 게 등 갑각류를 비롯하여 수생생물에 널리 분포하는 아스타잔틴은 빨간색을 띠며 지용성 색소입니다. 항산화효과가 높은 것으로 알려져 건강기능식품으로 판매되고 있습니다. 아스타잔틴은 (S,S), (R,S), (R,R)의 3종류의 광학 이성질체가 존재합니다.
180분인 현재 분석시간을 60분안에 단축화하고 피크의 분리도를 1.5 이상으로 유지하고자 합니다. 먼저 메서드 스카우팅의 방법대로 진행했습니다.
첫번째 유기용매에서 조건을 찾지 못해 두번째 용매조건을 찾았습니다. 두번째 용매조건은 코팅형컬럼에서는 사용할 수 없는 이동상을 썼기 때문에 결합형의 컬럼만 진행합니다.
두번재 유기용매에서는 Cellulose-SC와 n-hexane/THF의 조건에서 최적화할 수 있었습니다.
이제 선정된 컬럼과 유기용매 조건에서 isocratic조건을 찾아내어 최적화합니다.
isocratic비율을 최적화한 후 목표인 분리도 1.5 이상에서 60분 이내로 맞추기 위해 유기용매 함량을 조절합니다.
역상 HPLC
역상 HPLC에 적합한 화합물을 중심으로 진행합니다.
스카우팅 방법은 동일하지만 사용할 수 있는 컬럼은 결합형에 한정합니다.
비대칭의 탄소가 1개 존재하는 라세미 화합물이고 염을 형성하는 산성화합물을 가지고 스카우팅을 실시했습니다.
위와 같이 진행했을 때 Cellulose-SB와 pH 2.9, acetonitrile에서 최적화 할 수 있었습니다.
최적화된 조건에서 유기용매의 isocratic조건과 분리도 향상을 위해 다시 한번 최적화를 진행합니다.
따라서 최종적인 최적조건은 0.1% TFA와 아세토나이트릴 조건의 isocratic으로 최적화 할 수 있었습니다.
메서드 스카우팅에서 상기 방법과 같은 표에 따라 진행하시면 chiral물질의 메서드 스카우팅과 조건 최적화에서 시간을 줄일 수 있는 좋은 팁이 될 수 있으리라 봅니다.
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