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HPLC분석관련

역상 컬럼을 사용한 Oligonucleotide의 고분리 분석

HPLC분석관련 YMC 2015.10.30

역상 컬럼을 사용한 Oligonucleotide의 고분리 분석

올리고뉴클레오타이드 분석에 적합한 이온 페어 역상 HPLC

이동상의 보관 유지나 분리 비교

3종의 완충용액을 이용하여 사슬길이가 다른 oligodeoxythymidylic acid [d(T)2-20]의 분석을 동일 기울기 조건하에서 비교하였습니다.

초산완충액 및 인산완충액에서는 Retention이 작아서 분리가 잘 되지 않는 것을 볼 수 있습니다. 이에 반해 트리에틸아민-초산완충액에서는 Retention이 크고 하나의 염기 차이도 양호하게 분리되는 것을 볼 수 있습니다.

트리에틸아민(TEA), 다부틸아민(DBA)처럼 분자 내 플러스 해리기와 소수성 작용기를 가진 이온 페어 시약은 각각 해리된 올리고뉴클레오타이드와 전하적으로 중성의 이온 페어를 형성함으로써 C18 같은 역상 충전제에서 Retention을 높이고 분리를 향상시킵니다.

LC/MS분석에의 적용

이온 페어 시약의 종류·농도에 의한 분리나 MS감도의 비교

이온 페어 시약의 종류와 농도를 다르게 하여 분리도나 MS에서의 감도를 비교하여 보았습니다.

TEA와 DBA는 모두 휘발성 이온 페어 시약입니다. LC/MS분석에 적용할 수 있지만 동일한 염농도에서 TEA보다 DBA가 올리고뉴클레오타이드의 유지가 크고 MS의 검출감도도 양호합니다.

디부틸아민-아세트산 완충용액(DBAA)의 10 mM과 5mM을 비교하면 5mM에서 Retention이나 일부 분리가 저하되지만, MS 검출 감도는 향상되고 있습니다. LC/MS분석의 경우 5~10 mM DBAA/아세토나이트릴 (혹은 메탄올 등)을 기본 이동상으로, 분리와 감도의 밸런스를 고려하면서 유기용매의 종류나 기울기 정도를 최적화하는 것이 유효합니다.

miRNA의LC/MS분석

10 mM DBAA완충용액/아세토나이트릴을 이동상으로 miRNA의 21 nt과 22 nt의 혼합물을 분리하고 있습니다. 1nt 의 차이도 양호하게 분리하고 MS검출이 가능합니다.

이동상이나 컬럼 온도에 의한 2가닥 siRNA의 분리 비교

유기 실리카 하이브리드 컬럼 YMC-Triart C18을 이용하여 동일한 2가닥 siRNA을 다른 이동상 조건 (이온 페어나 유기 용매의 종류 등)에서 각각 컬럼 온도를 30~60℃의 사이에서 변경하면서 분석한 결과를 비교하였습니다.

Condition A, B 모두 컬럼 온도 상승에 따른 피크 형상은 양호하게 나왔습니다. 근접한 불순물의 분리가 향상되고 있습니다. DNA나 RNA 같이 분자량이 큰 화합물이 펩타이드나 단백질과 마찬가지로 1)고온 조건으로 물질 이동 속도가 개선되고 피크형상과 분리가 향상되는 경향이 있습니다.

Condition A의 모든 온도 및 Condition B의 30℃에서는 2가닥 RNA가 1피크로 검출되고 있지만 Condition B의 40℃ 이상에서는 컬럼 내에서 변성되어 1가닥 RNA가 각각 분리된 2피크로 검출되고 있습니다. 이처럼 고온 조건으로 2가닥에서 1가닥에 변성시키고 분석하는 "변성 HPLC(Denaturing HPLC)"은 유전자 변이 분석 등의 목적에 널리 쓰이고 있습니다.

같은 온도 조건 하에서 Condition A와 B에서 비변성 상태, 변성 상태의 차이를 볼 수 있도록 2가닥 DNA나 RNA변성은 온도 이외에도 염의 이온 강도 (종류 및 농도), pH, 용매의 극성 등의 영향을 받습니다. 분석 대상물과 목적(미변성 상태에서 분석, 또는 변성 상태 분석)에 따라 컬럼 온도와 이동상 조건을 최적화하는 것이 유효합니다.

pH 6.0, 65℃에서YMC-Triart C18의 내구성

아민계 이온 페어 시약을 포함한 중성 이동상과 고온 조건의 조합은 올리고뉴클레오타이드의 고분리 분석과 변성 HPLC에 최적이지만, 이런 조건에서는 일반적인 실리카기재 역상 컬럼은 내구성이 떨어져 연속 사용이 어렵습니다.

YMC-Triart C18컬럼은 유기 실리카 하이브리드기재에 치밀한 표면 수식을 하고 있기 때문에, 뛰어난 내구성을 보이고 올리고뉴클레오타이드의 HPLC분석에 최적입니다.

=관련 문의=

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5.이용제한을 통지 받은 회원이 그에 대해 이의가 있을 때에는 이의신청을 할 수 있습니다.
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1.이 약관은 2015년 8월 1일부터 시행합니다.
2.본 약관에서 규정되지 아니한 사항에 대해서는 국내법에서 정한 관계 법령 및 상 관행에 따릅니다.

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정보통신망이용촉진및정보보호등에관한법률 [시행 2019. 6. 25.] [법률 제16021호, 2018. 12. 24., 일부개정]

제 50조 (영리목적의 광고성 정보 전송 제한)

1.누구든지 전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하려면 그 수신자의 명시적인 사전 동의를 받아야 한다. 다만, 다음 각 호의 어느 하나에 해당하는 경우에는 사전 동의를 받지 아니한다. <개정 2016. 3. 22.>

①재화등의 거래관계를 통하여 수신자로부터 직접 연락처를 수집한 자가 대통령령으로 정한 기간 이내에 자신이 처리하고 수신자와 거래한 것과 동종의 재화등에 대한 영리목적의 광고성 정보를 전송하려는 경우
②「방문판매 등에 관한 법률」에 따른 전화권유판매자가 육성으로 수신자에게 개인정보의 수집출처를 고지하고 전화권유를 하는 경우

2.전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하려는 자는 제1항에도 불구하고 수신자가 수신거부의사를 표시하거나 사전 동의를 철회한 경우에는 영리목적의 광고성 정보를 전송하여서는 아니 된다.
3.오후 9시부터 그 다음 날 오전 8시까지의 시간에 전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하려는 자는 제1항에도 불구하고 그 수신자로부터 별도의 사전 동의를 받아야 한다. 다만, 대통령령으로 정하는 매체의 경우에는 그러하지 아니하다.
4.전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하는 자는 대통령령으로 정하는 바에 따라 다음 각 호의 사항 등을 광고성 정보에 구체적으로 밝혀야 한다.

①전송자의 명칭 및 연락처
②수신의 거부 또는 수신동의의 철회 의사표시를 쉽게 할 수 있는 조치 및 방법에 관한 사항

5.전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하는 자는 다음 각 호의 어느 하나에 해당하는 행위를 하여서는 아니 된다. <개정 2024. 1. 23.>

①광고성 정보 수신자의 수신거부 또는 수신동의의 철회를 회피ㆍ방해하는 행위
②숫자ㆍ부호 또는 문자를 조합하여 전화번호ㆍ전자우편주소 등 수신자의 연락처를 자동으로 만들어 내는 행위
③영리목적의 광고성 정보를 전송할 목적으로 전화번호 또는 전자우편주소를 자동으로 등록하는 행위
④광고성 정보 전송자의 신원이나 광고 전송 출처를 감추기 위한 각종 행위
⑤영리목적의 광고성 정보를 전송할 목적으로 수신자를 기망하여 회신을 유도하는 각종 행위

6.전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하는 자는 수신자가 수신거부나 수신동의의 철회를 할 때 발생하는 전화요금 등의 금전적 비용을 수신자가 부담하지 아니하도록 대통령령으로 정하는 바에 따라 필요한 조치를 하여야 한다.
7.전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하려는 자는 수신자가 제1항 및 제3항에 따른 수신동의, 제2항에 따른 수신거부 또는 수신동의 철회에 관한 의사를 표시할 때에는 해당 수신자에게 대통령령으로 정하는 바에 따라 수신동의, 수신거부 또는 수신동의 철회에 대한 처리 결과를 알려야 한다. <개정 2024. 1. 23.>
8.제1항 또는 제3항에 따라 수신동의를 받은 자는 대통령령으로 정하는 바에 따라 정기적으로 광고성 정보 수신자의 수신동의 여부를 확인하여야 한다.

[전문개정 2014. 5. 28.]

[시행일: 2024. 7. 24.] 제50조

제 74조 (벌칙)

1.다음 각 호의 어느 하나에 해당하는 자는 1년 이하의 징역 또는 1천만원 이하의 벌금에 처한다. <개정 2012. 2. 17., 2014. 5. 28.>

①제8조제4항을 위반하여 비슷한 표시를 한 제품을 표시ㆍ판매 또는 판매할 목적으로 진열한 자
②제44조의7제1항제1호를 위반하여 음란한 부호ㆍ문언ㆍ음향ㆍ화상 또는 영상을 배포ㆍ판매ㆍ임대하거나 공공연하게 전시한 자
③제44조의7제1항제3호를 위반하여 공포심이나 불안감을 유발하는 부호ㆍ문언ㆍ음향ㆍ화상 또는 영상을 반복적으로 상대방에게 도달하게 한 자
④제50조제5항을 위반하여 조치를 한 자
⑤삭제 <2014. 5. 28.>
⑥삭제 <2024. 1. 23.>
⑦제53조제4항을 위반하여 등록사항의 변경등록 또는 사업의 양도ㆍ양수 또는 합병ㆍ상속의 신고를 하지 아니한 자

2.제1항제3호의 죄는 피해자가 구체적으로 밝힌 의사에 반하여 공소를 제기할 수 없다.

[전문개정 2008. 6. 13.]