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HPLC분석관련
역상 크로마토그래피에서 분리를 결정하는 요인
HPLC분리에 영향을 주는 주요 인자
-고정상 (Stationary phase)
시료를 분리하기 위한 장 ＝ 컬럼（충전제）
-이동상 (Mobile Phase)
시료를 고정상으로 이송 = 용리액
-용질 (Analyte)
용질=분리대상화합물
HPLC에서 분리를 결정짓는 인자는 고정상과 이동상 그리고 분리할 화합물이 있습니다.
이중에서 오늘은 역상 크로마토그래피에서의 고정상에 대한 내용으로 진행을 하겠습니다.
역상의 컬럼은 보통은 C18 (Octadecyl silica; ODS)를 많이 사용합니다. 역상의 상당수가
C18으로 이루어져있다보니 역상은 C18만 있는 것으로 착각할 때가 있습니다.
하지만 순상에 비해 역상은 작용기도 다양하고 C18에서도 작용기 수식 방법등에 따라
분리 특성이 다르게 나타납니다.
그렇다면 역상크로마토그래피는 어떤 작용을 통해 분리를 진행할까요.
소수적 상호작용
소수적 상호작용은 말 그대로 작용기 자체가 비극성이다보니 분리하고자 하는 물질의 비극성도에 따라 상호작용의
크기가 달라지는 차이로 분리를 진행합니다. 그렇다면 작용기의 길이나 소수성에 따라 분리 정도가 달라진다는
의미가 될 수 있습니다.
즉 작용기의 알킬사슬이 길어지면 소수성이 커져서 물질이 컬럼에 오래 머무르게 되어 머무름 시간
(유지시간, Retention time)이 커지게 됩니다. 비극성 물질이 빨리 나오게 하고 싶으면 C1같은
작용기가 짧은 컬럼을 사용하고 늦게 나오게 하고 싶으면 C18이나 C30같은 알킬 사슬이 긴 컬럼을
사용하면 됩니다.
그럼 작용기 결합밀도가 높으면 컬럼의 비극성도(소수성)이 커져서 유지시간(Retention time)이
커지게 되겠습니다. 하지만 너무 높게 되면 작용기 사이에서 상호작용이 떨어져서 적당한 밀도까지만
작용기를 수식하게 됩니다.
이온적 상호작용
이온적 상호작용은 역상크로마토그래피에서 보통은 배제하고자 하는 상호작용입니다.
C18을 실리카표면에 수식하더라도 빈부분은 실리카의 실라놀(silanol)기가 나와 있기 때문에
영향이 없지는 않습니다. 그런 경우에 아래 그림과 같이 이온적 상호작용이 일어납니다.
이런 이온적상호작용이 C18컬럼에서는 문제가 생기는 경우가 종종 발생합니다. 따라서 실라놀기를 없에기 위해
End Capping과 같은 작업을 진행합니다. End capping은 실라놀기를 소수성을 가진 짧은 체인으로 막아서
실라놀의 영향을 없에는 작업입니다. End capping을 실시하기 전과 실시한 후를 비교해보면 아래 그림과 같이
특정 물질 분석 시 피크 모양이 변하는 것을 확인할 수 있습니다.
잔존 실라놀은 이온적 상호작용 뿐만 아니라 수소결합성에도 영향을 미칩니다.
수소결합성
수소결합성도 이온성과 비슷하지만 이온부분이 아닌 극성 부분과 상호작용을 일으킨다는 차이가 있습니다.
위에서 보는바와 같이 실라놀이 많을수록 수소결합성이 커짐을 확인할 수 있습니다.
배위적상호작용
배위적상호작용은 금속불순물과 배위성 화합물과 작용하는 상호작용입니다.
그림과 같이 금속 불순물이 많은 ODS의 경우 배위성 화합물 분석 시 여러가지 문제를 일으키게 됩니다.
따라서 배위성 화합물 분석 시에는 금속불순물이 거의 없거나 적은 컬럼을 사용하는 것이 좋습니다.
π-π 상호작용
π-π 상호작용의 경우 시료물질의 π전자와의 상호작용이 물질 분리에 영향을 미치는 경우입니다.
방향족 화합물을 분리하거나 이중결합, 삼중결합 등이 분자내에 있을 경우에는 π전자 상호작용을 가지는 컬럼을
사용할 경우 분리에 효과적일 수 있습니다.
위와 같이 역상크로마토그래피에서는 컬럼의 비극성 뿐만 아니라 여러가지 상호작용이 존재하게 됩니다.
이런 상호작용을 잘 알고 활용하여야 좋은 분석 데이터를 얻을 수 있습니다.
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