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HPLC분석관련
충전제의 Particle size와 분리
이번 시간에는 HPLC에서 가장 중요한 factor중의 하나인 입자경에 대해 알아보도록 하겠습니다. 입자경이 HPLC의 가장 중요한 factor중의 하나인 이유는 입자경으로서 HPLC를 규정한다고도 할 수 있기 때문입니다.
아래 그림에서 보시면 같은 충진제의 컬럼에 동일한 샘플로 동일한 유속의 동일한 이동상으로 분석했을 때 입자경에 따른 차이를 볼 수 있습니다. 
피크의 패턴은 동일하게 나오는 것을 알 수 있습니다. 하지만 2㎛의 입자크기를 가질 경우 검출되지 않았던 불순물이 검출된 것을 확인할 수 있습니다. 이것을 보았을 때 입자경이 작아지면 분리능이 좋아진다는 것을 확인할 수 있습니다.
왜 이런 현상이 일어나는 것일까요. 입자 크기가 고와지면 물질과 상호작용을 일으킬 수 있는 표면적도 그만큼 넓어질 것입니다. 입자경이 작아지면 같은 길이에서 이론단수가 더 커지게 됩니다. 그 결과로 분리능이 더 좋아지는 것이지요. (이론단수가 물질의 분리정도와 완벽히 일치하는 것은 아닙니다.)
초반에 HPLC를 규정짓는 것의 하나가 입자경이라고 말씀드렸습니다.
크로마토그래피에 대해서 배우게 될 때 가장 먼저 알게 되는 것은 TLC(Thin layer chromatography)와 Open column chromatography입니다. TLC는 얇은 막에 실리카 등의 충전제를 입힌 후 크로마토그래피를 실시하는 것이고, Open column은 보통 유리로 된 컬럼에 충전제를 채운 후 이동상을 들이부어 중력의 힘(보통은)으로 크로마토그래피를 실시하는 것입니다. 처음에 크로마토그래피에 대해 알게 될 때는 두 가지 모두 혼합물을 분리할 때는 성질이 비슷한 물질의 잘 분리하는 유용한 방법으로 알려졌습니다. 물론 여타 다른 분리 방법에 비해서는 분리능이 좋은 편입니다. 하지만 크로마토그래피에서는 가장 분리능이 낮은 방법들입니다. 그 이유는 입자경 때문입니다.
TLC나 open column을 진행할 때는 50㎛이상의 입자경을 가진 충전제들을 사용합니다. 입자경이 더 작을 경우 open column은 중력의 힘만으로 제대로 전개하기 힘들것입니다. TLC의 경우에는 가격도 비싸지고 전개속도도 느려질 것입니다. 입자경이 큰 충전제들을 사용하기 때문에 크로마토그래피중에서는 분리능이 낮은 크로마토그래피인 것입니다. 좀 더 입자 사이즈가 작아지면 전개 속도가 느려지기 때문에 펌프 등으로 이동상을 밀어주어야 합니다.
펌프로 이동상을 밀게 되면 입자경의 차이에 따라 펌프에 가해지는 back pressure가 다르게 나타납니다. 이 때 걸리는 back pressure의 크기에 따라 LPLC, MPLC, HPLC를 나누게 됩니다.(LPLC : Low pressure Liquid Chromatography, MPLC : Midium Pressure Liquid Chromatography, HPLC : High Pressure Liquid Chromatography or High Performance Liquid Chromatography)
하지만 이들을 규정 짓는 압력에 관해서는 애매한 부분이 많습니다. 결국 입자경의 크기로 가능한 컬럼을 확인하여 시스템의 차이를 둘 수 있습니다. 대체로 20㎛ 이하의 입자경을 가진 충전제를 사용하여 분리하는 경우 HPLC로 부르고 그 이상의 입자경일 경우 MPLC 또는 LPLC라고 합니다.
간혹 분석용 HPLC에서 분리한 데이터를 MPLC의 분취시스템에서 구현하고자 하는 경우가 있는 데 이런 경우 상당수가 실패하는 원인중 하나가 분리능의 저하를 감안하지 못하는 것입니다. TLC나 Open column에서의 결과를 바탕으로 MPLC등으로 분리하고자 할 때는 MPLC가 더 나은 결과를 보여주지만 HPLC의 데이터는 MPLC에서는 충분한 분리능을 확보할 수 없습니다.
즉 내가 가진 샘플의 상황에 따라 더 작은 입자경이 필요할 때는 그에 맞는 시스템도 구현이 가능한 지 확인해보아야 합니다.
물론 MPLC나 LPLC가 HPLC보다 분리능이 떨어진다고 해서 전혀 쓸모가 없는 장비는 아닙니다. 충전제의 입자경이 클 수록 충전제 가격이 저렴하기 때문에 샘플 전처리 등에서 좀 더 여유로울 수는 있습니다. 분리하고자 하는 물질 수가 적고 각 물질간의 Rf차이도 많이 날 경우에는 MPLC나 LPLC에서도 완전분리가 가능할 수도 있습니다. 또한 단백질 같은 바이오프로덕트의 경우 높은 압력이 문제가 될 소지도 있어서 생산용으로 MPLC가 사용되는 경우도 있습니다.
분취용 스케일에서 MPLC와 HPLC를 각각 사용해야 할 경우에는 두 가지를 동시에 구현할 수 있는 장비를 사용하는 것이 좋습니다. MPLC와 HPLC, 추가로 Recycling을 한 장비에서 동시에 활용하고자 한다면 LC Forte/R을 사용할 수 있습니다. 자세한 내용은 여기를 참조하십시오.
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