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메서드(Method) 최적화
Agenda
I.컬럼(충전제)와 대상 화합물이 원치 않는 상호 작용의 영향.
II. 화합물의 성질과 이동상 조건의 미스 매치에 의한 피크 형상
HPLC를 분석하는데 있어 Method의 최적화를 위한 과제로 Peak의 모양에 문제가 생기는 경우 이를 개선하는 것과 분리, 분석 시간을 최적화하는 것으로 나눌 수 있습니다.
먼저 피크 형상을 개선하기 위한 포인트를 먼저 살펴보도록 하겠습니다.
피크형상 불량의 개선
I. 컬럼(충전제)와 대상 화합물이 원치 않는 상호 작용의 영향
말그대로 컬럼과 대상 화합물이 원치 않는 상호 작용을 일으켰을 때 어떤 영향이 있고, 어떻게 개선해야 되는지에 대한 내용입니다. 부수적인 상호작용에 대해서는 이미 두번의 포스트를 통해 말씀드린바 있습니다.
http://blog.naver.com/ymc_korea/220317416946
http://blog.naver.com/ymc_korea/220340057760
1. 염기성 화합물의 피크 형상 개선 포인트
1)이동상 pH및 유기 용매의 종류의 영향
Chlorpheniramine은 염기성 화합물입니다.
이를 pH 6.9와 Acetonitrile 용매에서 분석하면 다음과 같은 크로마토그램을 얻을 수 있습니다.
Tailing factor가 1.74로 높게 나오는 것을 확인할 수 있습니다.
이를 개선하기 위해 pH와 유기용매를 바꾸어 보았습니다.
염기성화합물과 잔존실라놀기와의 상호작용을 약화시킴으로써 피크 형상이 개선되는 것을
확인할 수 있습니다. 즉, 산성이동상을 사용할 경우 실라놀기의 해리를 억제하고, 메탄올을
사용할 경우 Proton 공여성 용매로 tailing factor가 개선되는 것입니다.
2) 컬럼 온도의 영향
말그대로 컬럼 온도를 바꾸어 주었을 때 어떤 영향이 있는지를 살펴보았습니다.
저온일 경우 염기성 화합물은 tailing이 일어나기 쉽습니다. 잔존 실라놀과 염기성화합물의 흡탈착 속도가
느려지기 때문입니다. 이런 경우 컬럼 온도를 높게 하면 tailing factor가 개선되는 것을 확인할 수 있습니다.
그보다 End-Capping이 양호하고 온도 의존성이 작은 컬럼을 선택하는 것이 이런 영향을 줄일 수 있는
방법이 될 것입니다.
2. 산성·배위성 화합물의 피크 형상 개선 포인트
1) 산세정을 통한 불순물 제거
산성, 배위성 화합물의 피크형상 개선 포인트를 살펴보도록 하겠습니다. 식품 보존료를 분석해보겠습니다.
그림과 같이 dehydroacetic acid의 분석시에 tailing factor가 2.2 까지 나오는 것을 확인할 수 있습니다.
산성·배위성 화합물은 충전제에 잔존하는 불순물, 특히 금속 양이온성 화합물의 영향으로 피크 형상 악화 및
재현성 불량을 일으킬 수 있습니다. 이럴 경우 인산 세정에 의해 개선이 되는 경우도 있습니다.
20 mM인산/아세토나이트릴(50/50)용액을 10컬럼 볼륨 정도 컬럼에 통액시켜준 후에 다시 분석해보도록
하겠습니다.
그림에서와 같이 산에 의해 세정한 후에 tailing factor가 개선된 것을 확인할 수 있습니다.
이런 오류를 줄이기 위해서는 처음부터 금속 불순물이 적거나 거의 없는 충전제로 만든 컬럼을
사용하시는 것이 좋습니다.
II. 화합물의 성질과 이동상 조건의 미스 매치에 의한 피크 형상
지난 포스트에서는 컬럼과 대상 화합물간의 원치 않는 상호작용이 일어났을 때의 피크 형상 최적화에
대해 알아보았습니다. 이번 포스트에서는 화합물의 성질과 이동상 조건의 미스 매치에 의한 피크 형상
불량과 관련하여 메서드 최적화를 위한 방법에 대해 알아보도록 하겠습니다.
1.유기용매 선택에 의한 피크 형상 개선 사례
위 그림과 같은 부분 입체 이성질체를 분리하기 위해 유기용매의 종류에 따른 분리 양상을 확인해 보았습니다.
그림에서도 볼 수 있듯이 유기 용매의 종류에 따라 피크 형상이 크게 다를 수 있습니다. 이는 화합물의
용해성의 영향으로 볼 수 있습니다. 목적하는 성분의 용해성이 높은 용매를 선택하는 것이 좋은 피크
형상을 만드는 데 유효함을 알 수 있습니다. pH에 대해서도 마찬가지입니다.
벤조산은 pKa값이 4.2인 물질입니다. 이를 pKa 부근의 pH로 맞추어서 분석을 진행할 경우 다음과 같은
현상이 일어나게 됩니다.
크로마토그램에서 볼 수 있듯이 피크 모양이 leading이 생기고 형상이 안 좋아지는 것을 볼 수 있습니다.
이를 개선하기 위해 pKa값에서 1 이상 변경하여 분석을 진행하였습니다.
화합물의 pKa(해리 상태:비 해리 상태=1:1)부근에서는 Retention time의 변동이 클 뿐 아니라 피크형상이
나빠질 수 있습니다. pH는 화합물의 pKa에서 1이상 떼어 놓는 것이 바람직합니다. 메서드 검토 과정에서
pH별로 Retention의 변화나 피크 형상의 변화를 확인하는 작업이 필요합니다.
2. 완충능력과 화합물 pKa의 영향
pH를 맞출 때 완충능력도 피크의 형상과 관계 있는 지 알 수 있는 그림이 바로 아래 그림입니다.
특히 이동상의 pH와 화합물의 pKa가 가까울수록 완충능력의 효과를 받기 쉬운 것을 확인할 수 있습니다.
이런 완충능력의 효과는 샘플의 부하량이 늘어날수록 더 크게 나타나는데요. 위 그림과 같이 완충효과가
있을 경우에는 부하량에 대한 피크 형상 불량이 나타나지 않음에 비해 완충효과가 없을 경우에는 부하량에
따라 leading이 생기는 것을 확인할 수 있습니다. 기본적으로 이동상은 해당 pH에서 완충효과가 높은 것을
선택하는 것이 좋습니다. 역상크로마토그래피에서 사용하는 완충용액이나 첨가제는 이전 포스트를
참고해주세요. http://blog.naver.com/ymc_korea/220340057760
화합물이나 원인에 따른 대응책을 취함으로써 피크 불량은 회피할 수 있습니다. 무엇보다 메서드개발에 있어서
기본적인 원칙을 지키는 것이 중요합니다. 다만 모든 화합물에 대해 항상 최고의 조건을 설정할 수는 없는 것이
현실입니다. 규정된 조건이 있고 샘플 화합물의 구성이 복잡하기 때문이지요. 컬럼(충전제)요인에 의한
피크 형상 불량이 감소되면 조건을 최적화하기 쉽습니다. 즉 컬럼 선택이 중요한 요인이라고 볼 수 있습니다.
잔존 실라놀을 극한까지 줄이고, 폭 넓은 pH와 높은 온도에서도 사용할 수 있으며, 금속 불순물 등을 철저히
제거한 컬럼이 이런 메서드 개발에 효과적입니다.
*YMC에서는 Triart 컬럼이 이에 해당합니다.
Triart 주요사양
|
기재 |
유기실리카하이브리드 |
|
관능기 |
C18, C8, Phenyl, PFP, Diol(HILIC) (Polymeric 결합) |
|
입자경 |
1.9 mm, 3 mm, 5 mm |
|
세공경 |
12 nm |
|
탄소함유량 |
C18：약 20% C8：약 17% |
|
End-Capping |
Multistage End-capping |
|
사용pH범위 |
1-12 |
|
사용온도상한 |
70℃ for pH 1-7 50℃ for pH 7-12 |
III. 시스템에 기인하는 불량
컬럼 문제가 아닌 경우에도 시스템 배관의 유로 내부에 축적된 금속 이온성 오염물과 배위성 화합물이
샘플내의 배위성 화합물과 상호 작용하여 피크 형상에 불량이 생기거나 분석 재현성이 떨어지는 현상이
생길 수 있습니다. 이런 경우에 2~6N 정도의 질산용액이나 킬레이트 형성 능력을 가진 EDTA를 첨가한
용액으로 시스템을 세척하면 피크 형상이나 분석 재현성이 개선될 가능성이 있습니다.
시스템을 세척하는 순서는 먼저 컬럼을 시스템에서 제거하고 컬럼 연결 부분에 관을 연결하여 직접
폐액으로 흐르게 합니다. 순서는 물, 2N 질산, 물, IPA 순서로 각각 15mL씩 흘려줍니다.
위 그림과 같이 Hinokitiol을 분석할 때 시스템에 금속이물이 있을 경우 피크 모양이 안 좋게 나오는 경우가
있습니다. 질산 세척 후에는 피크 모양이 개선된 것을 확인할 수 있습니다. 컬럼과 이동상에서 기인한 피크
불량이 아닌 시스템에서 생기는 문제이기 때문에 경험에 의한 판단이 필요합니다.
시스템의 세정에 의해 개선할 수 없는 경우에는 불량의 원인이 되고 있는 배관이나 부품을 교체하여 개선될
가능성도 있습니다. 근본적으로는 유로를 최대한 비금속화하는 것도 이런 문제를 미연에 방지하는 효과를
가져올 수 있습니다.
상기 그림은 질산 세척을 실시했음에도 피크 모양이 개선되지 않아 샘플 루프를 교환하여 효과를 본 경우
입니다. 금속인 샘플루프를 플라스틱 재질로 교체하면서 Tailing factor가 좋아진 것을 확인할 수 있습니다.
IV. 샘플의 주입 조건에 의한 피크 형상 불량
HPLC에 샘플을 주입할 때 이동상보다 용출력이 강한 용매에 녹여서 주입하면 피크 갈라짐 등의
문제가 생길 수 있습니다.
위 그림과 같이 초기 이동상보다 용출력이 강한 용매에 샘플을 녹여서 주입했을 때 피크 갈라짐이 생기는 것을
확인하였습니다. 이를 초기 이동상에 녹여서 주입하면 문제 없이 정상적으로 용출되고 있는 것을 확인할
수 있습니다. 샘플은 초기 이동상이나 그보다 용출력이 작은 용매에 용해하는 것이 바람직합니다.
하지만 상황에 따라 초기이동상에서의 가용성 문제나 안정성 문제로 강한 용출력을 가진 용매를 선택할 수
밖에 없는 경우도 있습니다. 이런 경우에는 가급적이면 고농도로 조제한 후 주입용량을 줄여 주는 것이
좋습니다.
가용성이 높은 용매에 고농도로 조제한 후에 이동상으로 희석하는 것도 효과적인 방법이 될 수 있습니다.
이동상의 pH와 완충능력이 다른 경우
이온성 화합물의 경우는 샘플을 용해한 용매와 이동상의 pH 와 완충능력이 다른 경우에도 피크 불량이 발생할 수 있습니다.
위 그림에서는 샘플 용해 용매와 이동상간의 pH차이가 커서 피크가 갈라지는 현상입니다.
이를 해결하기 위해 이동상에서 2배 희석해서 pH차이를 작게할 경우 문제가 해결되는 것을 확인할 수
있습니다. 물론 고농도로 조제하여 주입 용량을 적게 하는 방법도 하나의 해결방법이 될 수 있습니다.
컬럼에 의한 차이를 보여주는 경우도 있습니다.
컬럼의 기재 설계와 표면수식에 의한 차이라고 볼 수 있습니다. 특히 실라놀기가 이온화하는 조건(pH>중성)
에서는 샘플 양이 적은 저부하 영향이 큰 경우가 있습니다. 위의 그림에서 샘플 농도가 낮아질수록
Tailing factor가 증가하는 것을 확인할 수 있습니다. 이런 경우에는 잔존 실라놀을 얼마만큼 불활성화
시켰는가가 피크 형상 개선에 도움을 줄 수 있습니다.
YMC-Triart C18은 위의 그림에서도 보는 바와 같이 잔존 실라놀을 극한까지 줄였기 때문에 피크 형상
문제가 적고 미량 분석시에 감도나 정량성 향상에 효과적이라고 할 수 있습니다.
위 그림은 시료를 녹인 용액에서 샘플 화합물의 안정성과 관련된 부분입니다. 시료를 녹일 때 용해도나
pH만을 고려했을 때 안정성 부분을 생각하지 못하는 경우도 있습니다. 위 그림에서 조제 직후에는 정상적인
데이터를 보였지만 시료의 안정성이 문제가 될 경우 보관 시에 시료가 분해되는 경우도 있습니다.
시료를 조제할 때는 안정한 용매를 사용하거나 조제 후 주입 시까지 적정한 시간을 확인하여 선택하는 것이 좋습니다.
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제 50조 (영리목적의 광고성 정보 전송 제한)
- 1.누구든지 전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하려면 그 수신자의 명시적인 사전 동의를 받아야 한다. 다만, 다음 각 호의 어느 하나에 해당하는 경우에는 사전 동의를 받지 아니한다. <개정 2016. 3. 22.>
- ①재화등의 거래관계를 통하여 수신자로부터 직접 연락처를 수집한 자가 대통령령으로 정한 기간 이내에 자신이 처리하고 수신자와 거래한 것과 동종의 재화등에 대한 영리목적의 광고성 정보를 전송하려는 경우
- ②「방문판매 등에 관한 법률」에 따른 전화권유판매자가 육성으로 수신자에게 개인정보의 수집출처를 고지하고 전화권유를 하는 경우
- 2.전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하려는 자는 제1항에도 불구하고 수신자가 수신거부의사를 표시하거나 사전 동의를 철회한 경우에는 영리목적의 광고성 정보를 전송하여서는 아니 된다.
- 3.오후 9시부터 그 다음 날 오전 8시까지의 시간에 전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하려는 자는 제1항에도 불구하고 그 수신자로부터 별도의 사전 동의를 받아야 한다. 다만, 대통령령으로 정하는 매체의 경우에는 그러하지 아니하다.
- 4.전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하는 자는 대통령령으로 정하는 바에 따라 다음 각 호의 사항 등을 광고성 정보에 구체적으로 밝혀야 한다.
- ①전송자의 명칭 및 연락처
- ②수신의 거부 또는 수신동의의 철회 의사표시를 쉽게 할 수 있는 조치 및 방법에 관한 사항
- 5.전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하는 자는 다음 각 호의 어느 하나에 해당하는 행위를 하여서는 아니 된다. <개정 2024. 1. 23.>
- ①광고성 정보 수신자의 수신거부 또는 수신동의의 철회를 회피ㆍ방해하는 행위
- ②숫자ㆍ부호 또는 문자를 조합하여 전화번호ㆍ전자우편주소 등 수신자의 연락처를 자동으로 만들어 내는 행위
- ③영리목적의 광고성 정보를 전송할 목적으로 전화번호 또는 전자우편주소를 자동으로 등록하는 행위
- ④광고성 정보 전송자의 신원이나 광고 전송 출처를 감추기 위한 각종 행위
- ⑤영리목적의 광고성 정보를 전송할 목적으로 수신자를 기망하여 회신을 유도하는 각종 행위
- 6.전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하는 자는 수신자가 수신거부나 수신동의의 철회를 할 때 발생하는 전화요금 등의 금전적 비용을 수신자가 부담하지 아니하도록 대통령령으로 정하는 바에 따라 필요한 조치를 하여야 한다.
- 7.전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하려는 자는 수신자가 제1항 및 제3항에 따른 수신동의, 제2항에 따른 수신거부 또는 수신동의 철회에 관한 의사를 표시할 때에는 해당 수신자에게 대통령령으로 정하는 바에 따라 수신동의, 수신거부 또는 수신동의 철회에 대한 처리 결과를 알려야 한다. <개정 2024. 1. 23.>
- 8.제1항 또는 제3항에 따라 수신동의를 받은 자는 대통령령으로 정하는 바에 따라 정기적으로 광고성 정보 수신자의 수신동의 여부를 확인하여야 한다.
제 74조 (벌칙)
- 1.다음 각 호의 어느 하나에 해당하는 자는 1년 이하의 징역 또는 1천만원 이하의 벌금에 처한다. <개정 2012. 2. 17., 2014. 5. 28.>
- ①제8조제4항을 위반하여 비슷한 표시를 한 제품을 표시ㆍ판매 또는 판매할 목적으로 진열한 자
- ②제44조의7제1항제1호를 위반하여 음란한 부호ㆍ문언ㆍ음향ㆍ화상 또는 영상을 배포ㆍ판매ㆍ임대하거나 공공연하게 전시한 자
- ③제44조의7제1항제3호를 위반하여 공포심이나 불안감을 유발하는 부호ㆍ문언ㆍ음향ㆍ화상 또는 영상을 반복적으로 상대방에게 도달하게 한 자
- ④제50조제5항을 위반하여 조치를 한 자
- ⑤삭제 <2014. 5. 28.>
- ⑥삭제 <2024. 1. 23.>
- ⑦제53조제4항을 위반하여 등록사항의 변경등록 또는 사업의 양도ㆍ양수 또는 합병ㆍ상속의 신고를 하지 아니한 자
- 2.제1항제3호의 죄는 피해자가 구체적으로 밝힌 의사에 반하여 공소를 제기할 수 없다.