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HPLC의 구성
HPLC 의 구성과 Pump
크로마토그래피 그 중에서도 액체크로마토그래피, 그 중에서 HPLC에 대해 알아보도록 하겠습니다. HPLC는 High Performance Liquid Chromatography의 약자로 고성능액체크로마토그래피로 번역할 수 있습니다. 다른 말로는 High Pressure Liquid Chromatography로도 불립니다. 두 가지 이름으로 불리는 이유는 특성 때문입니다. 성능으로 비교하면 높은 분리능을 가지고 있기 때문에 High Performance가 되고, 높은 성능을 내기 위해서는 펌프가 높은 내압에 견뎌야 하기 때문에 High Pressure라고도 불립니다. High Pressure라고 불리는 또 한가지 이유는 MPLC와 LPLC와 비교하기 때문입니다. MPLC는 Medium Pressure, LPLC는 Low pressure를 사용합니다.
(압력에 대한 추가 설명은 다음의 Link에서.. http://blog.naver.com/ymc_korea/220315460310 )
흔히 HPLC라면 분석용의 미량분석만을 위한 장비로 오해하기 쉽습니다. 하지만 이름에서 이미 설명드렸다시피 높은 분리능(고성능)과 높은 내압을 견디는 액체크로마토그래피를 HPLC로 표현할 수 있습니다. 크기의 문제가 아니라는 말씀입니다. 보통은 20um이하의 작은 Particle size를 충전한 컬럼을 사용하면 HPLC 로 분류합니다. 이런 경우에는 높은 내압이 발생하기 때문에 컬럼도 스테인리스 컬럼을 사용합니다. 생산용으로 작은 particle size의 충전제를 사용하면 HPLC라고 불립니다.
HPLC의 구성은 어떻게 될까요? 보통은 다음과 같이 나눕니다.
언뜻 봐서는 비슷한 구성을 보입니다. HPLC는 기본적으로 이동상으로 불리는 용매에서 펌프를 지나 컬럼을 통과하여 디텍터를 통해 waste 됩니다. 이 때 시료 주입기(Injector)를 통해 샘플을 컬럼으로 주입하고 분리된 물질을 디텍터로 확인합니다.
Binary gradient system
Quaternary gradient system
위와 같이 여러개의 용매를 사용하지 않고 한개의 펌프에 하나의 용매만 사용하는 Isocratic system(등용매시스템)도 있습니다. 위와 같이 두가지 이상의 용매를 사용하는 경우에 Gradient system(기울기용리시스템)으로 활용할 수 있습니다. 기울기용리란 분석이나 분취 중에 용매의 세기가 변하는 것을 말합니다.
Gradient system에서 펌프는 두 가지 구성을 가집니다. 하나는 펌프가 하나이고 밸브의 체인지로 4채널까지 gradient를 이루는 시스템과 펌프하나에 이동상 하나를 연결하여 2채널 Gradient를 이루는 시스템입니다. 물론 아래와 같이 펌프 하나를 두고 2채널로 gradient를 둘 수도 있습니다.
두가지 시스템은 장단점이 있습니다만 일반적인 분석용 HPLC에서는 4채널 gradient system 을 많이 사용합니다. 여러 용매를 사용할 수 있기 때문입니다. 하지만 4채널 gradient의 경우 밸브 체인지를 통해 gradient를 만들어 낸 다는 점은 단점이 될 수도 있습니다. A와 B를 7대 3으로 섞을 경우 밸브체인지 방식은 7이라는 시간동안 A용매의 밸브를 열고 3이라는 시간 동안 B밸브를 여는 방식입니다. 분석용 HPLC처럼 작은 컬럼과 작은 유속에서는 나름 정확한 Gradient 효과를 볼 수 있지만 유속이 커지고 컬럼이 커지게 되면 상당히 부정확해질 수 있습니다.
Binary pump를 쓸 경우 두 펌프의 유속 차이로 Gradient를 만들기 때문에 상당히 정확하게 만들 수 있지만 펌프가 두개로 늘어나서 가격이 비싸지고, 펌프의 정량유속범위에서만 정밀한 gradient를 만들 수 있습니다. 예를 들어 A를 0에서 100으로 올리는 gradient를 줄 경우 밸브체인지인 경우 밸브의 정확도만 좋다면 무리없이 gradient를 만들 수 있지만 binary일 경우 10ml 펌프에서 정량범위가 0.1ml부터라고 한다면 1%이하의 농도는 정확성이 떨어지게 됩니다.
두 가지 방식 모두 장단점을 가지고 있어 어떤 것이 좋다고 말할 수는 없지만 분석용에서 R&D용 분취시스템까지는 밸브체인지 방식이 효율적이고 그 이상의 scale에서는 용매별로 펌프가 따로 있는 것이 맞다고 할 수 있습니다. Gradient와 펌프의 관계는 추후에 다시 자세히 설명하겠습니다.
컬럼은 앞의 포스트에서 설명드린바 있는 충전제로 채워진 원통형 관을 씁니다. 분리의 정확도와 재현성은 시스템이 좌우하지만 분리여부는 컬럼이 좌우하기 때문에 HPLC에서 무엇보다 중요한 소모품입니다. 컬럼에 대해서도 계속해서 포스트 하도록 하겠습니다.
컬럼에서 분리된 샘플은 디텍터를 통해 확인합니다. 샘플의 분리는 컬럼에서 이루어지지만 샘플의 확인은 눈으로 할 수 없기 때문에 디텍터의 역할도 상당히 중요합니다. 디텍터는 여러가지 종류가 있으나 일반적으로 UV detector를 많이 사용합니다. 하지만 시료의 특성에 따라 이에 맞는 디텍터를 선정하는 것도 물질 분석시에 좋은 데이터를 얻을 수 있는 방법입니다.
디텍터는 다음 표와 같은 종류와 특성이 있습니다.
인젝터는 수동 인젝터와 오토인젝터로 구분할 수 있습니다만 수동으로 주입하는 것과 기기에서 자동으로 주입하는 방식의 차이로 나눌 수 있습니다.
이외에도 추가 액세서리로 Online-Degasser, column oven, sample cooler 분취이상에서는 Fraction collector가 있습니다.
On-line Degasser는 컬럼내에 버블이 들어가서 피크에 이상이 생기고 컬럼이 망가지는 일을 막기위해 이동상의 가스를 제거하는 역할을 하는 장치입니다.
Column oven(or cooler)는 온도에 따라 분리나 피크모양의 차이가 있을 경우 컬럼을 일정한 온도로 유지시켜 주기 위한 장치입니다.
Sample cooler는 분석 시간이 오래 걸릴 경우 샘플이 온도에 따라 변성이 있을 수 있을 때 온도를 낮춰서 분석 전까지 일정한 품질을 유지시켜주기 위한 장치입니다.
Fraction collector는 분취용 크로마토그래피에서 특정 피크만을 다시 받아내어 높은 순도의 샘플을 얻고자 할 때 자동으로 샘플을 받아내는 장치입니다.
각 장치에 대한 자세한 내용은 다음 포스트에서 설명하기로 하겠습니다.
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