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LC TOF-MS를 이용한 Diltiazem 대사물의고감도, 고처리량분석
LC TOF-MS를이용한 Diltiazem 대사물의고감도, 고처리량분석
Noriko Shoji1; Chie Yokoyama1; Naohiro Kuriyama1; Jun Watanabe2; Haruo Hosoda2; Joji Seta2; Noriyuki Iwasaki2
1YMC Co., Ltd., Komatsu , Japan; 2Bruker Daltonics K. K., Yokohama, Japan
Introduction
LC/MS는 약물대사에서 정성, 정량 분석과 오늘날의 약물동태학에 있어서 매우 중요하다. LC를 이용한 분석은 복잡한 매트릭스에서 대사물을 측정하고, 완만한 그래디언트와 긴 분석시간을 이용해 완전분리(예를 들어 한번 분석에 60분정도)하기 때문에 매우 중요한 변수이다. 최근에는 많은 컬럼이 미세입자를 채용하여 LC분석에서 많은 어플리케이션과 높은 분리능, 고속분석을 수행하는 것이 일반적이 되었다.
본 연구에서 우리는 LC/TOF-MS와 미세입자 충전 컬럼을 이용하여 고감도, 고처리량 대사물 분석을 실시하였다.
기기 및 메서드
샘플 준비
인간 간세포 S9에서 Diltaizem(DTZ)의 In vitro 대사:
DTZ, NADPH regeneration system solution A (NADP+, Glucose-6-phosphate, MgCl2 in H2O), NADPH regeneration system solution B (Glucose-6-phosphate dehydrogenase in sodium citrate buffer), 인간 간세포 S9을 100mM 인산버퍼(pH 7.4)에 섞는다. 혼합물을 섭씨 37도에서 overnight(17시간정도)하면서 배양하였다. 대조샘플은 DTZ을 넣지 않고 준비하였다. [혼합물 배양의 최종 농도; 100 μM DTZ, 1.6 mM NADP, 3.3 mM Glucose-6-phosphate, 0.4 U/mL Glucose-6-phosphate dehydrogenase, 3.3 mM MgCl2, 2 mg/mL S9 protein]
혼합물 배양액의 고상추출 (SPE: Solid Phase extraction)
혼합물 배양액은 YMC Dispo SPE C18컬럼 (100mg/mL)로 진행하였고, 이를 LC/TOF-MS에 도입하였다.
1. 2 mL MeOH로 컨디셔닝
2. 2 mL 0.1% CH3COOH 로 평형화
3. 샘플 250 μL 주입
4. 1 mL MeOH로 용출
5. 건조하고 500 μL H2O로 다시 용해
LC/TOF-MS 조건
HPLC: Agilent 1200SL system
Column: Hydrosphere C18 (YMC Co., Ltd.), 5 μm, 150x2.0 mmI.D.
Eluent: A) 20 mM HCOONH4 B) Methanol
Gradient: 25%B (0-3.0min), 25-80%B (3-21min), 80%B (21-24min)
Flow Rate: 0.2 mL/min
Column Oven Temperature: 37 deg C
Injection volume: 3 μL
Mass instrument: micrOTOF II (Bruker Daltonics)
ESI, positive mode, m/z 100 – 1000
고처리량 LC/TOF-MS 조건
HPLC: Agilent 1200SL system
Column: YMC-UltraHT Hydrosphere C18 (YMC Co., Ltd.), 2 μm, 50x2.0 mmI.D.
Eluent: A) 20 mM HCOONH4 B) Methanol
Gradient: 25%B (0-0.5min), 25-80%B (0.5-3.5min), 80%B (3.5-4min)
Flow Rate: 0.4 mL/min
Column Oven Temperature: 37 deg C
Injection volume: 1 μL (reduced to 1/3)
Mass instrument: micrOTOF II (Bruker Daltonics)
ESI, positive mode, m/z 100 – 1000
실험 및 결과
먼저 일반적인 LC/TOF-MS조건에서 분석하였다; 컬럼 충전제 입자경 5 μm, 컬럼사이즈 150 X 2 mm, 유속 0.2 ml/min, 분석시간 24 min, 주입량 3 μl. 결과는 매우 뛰어난 분리결과를 얻을 수 있었다. 그리고 de-methylation (-CH2), ethylation (-C2H4), de- and de-acetylation (-COCH2) 같은 많은 대사물이 검출되었다 (Figure 3).
대사물들은 고감도 TOF를 사용하였을 때(검출된 피크의 매스 스펙트럼을 통한 분자식과 동위원소 패턴분석, Figure 4, Table 1) 가능한 정확한 질량 검출법인 hrEIC(high resolution extracted ion chromatogram) 통해 확인되었다.
다음으로는, 샘플을 2um이하의 입자경 컬럼(컬럼 길이는 50mm의 쇼트컬럼)을 이용한 고처리량 LC/TOF-MS조건을 이용하여 분석하였다. 유속은 0.4ml/min로 올려서 처리량을 올렸다. 감도상승이 예상되어 주입량은 1μl로 줄였다. 결과적으로 이전 조건에서 검출된 모든 대사물들이 분석이 가능하였다. 이전 조건에서 주입량을 줄여서 동일한 분석 intensity를 얻는 것은 감도가 상승한 것으로 볼 수 있다. 게다가 이전 조건과 동일한 분리능의 피크를 얻기 위해 컬럼 길이를 줄임에도 불구하고 입자경이 작은 충전제를 사용하여 높은 분리능을 유지할 수 있음을 확인하였다(Figure 5).
결론
1. 미세입자경 컬럼과 LC/TOF-MS를 사용한 대사물 분석은 분석시간 상승과 뛰어난 분리를 동시에 달성할 수 있다.
2. 대사물들은 고분리능 TOF의 뛰어난 성능으로 MS/MS를 사용하지 않고도 분자식과 동위원소 패턴을 분석하여 확정할 수 있었다.
* 본 연구는 Bruker와 공동 연구 진행한 건임.
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제 50조 (영리목적의 광고성 정보 전송 제한)
- 1.누구든지 전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하려면 그 수신자의 명시적인 사전 동의를 받아야 한다. 다만, 다음 각 호의 어느 하나에 해당하는 경우에는 사전 동의를 받지 아니한다. <개정 2016. 3. 22.>
- ①재화등의 거래관계를 통하여 수신자로부터 직접 연락처를 수집한 자가 대통령령으로 정한 기간 이내에 자신이 처리하고 수신자와 거래한 것과 동종의 재화등에 대한 영리목적의 광고성 정보를 전송하려는 경우
- ②「방문판매 등에 관한 법률」에 따른 전화권유판매자가 육성으로 수신자에게 개인정보의 수집출처를 고지하고 전화권유를 하는 경우
- 2.전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하려는 자는 제1항에도 불구하고 수신자가 수신거부의사를 표시하거나 사전 동의를 철회한 경우에는 영리목적의 광고성 정보를 전송하여서는 아니 된다.
- 3.오후 9시부터 그 다음 날 오전 8시까지의 시간에 전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하려는 자는 제1항에도 불구하고 그 수신자로부터 별도의 사전 동의를 받아야 한다. 다만, 대통령령으로 정하는 매체의 경우에는 그러하지 아니하다.
- 4.전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하는 자는 대통령령으로 정하는 바에 따라 다음 각 호의 사항 등을 광고성 정보에 구체적으로 밝혀야 한다.
- ①전송자의 명칭 및 연락처
- ②수신의 거부 또는 수신동의의 철회 의사표시를 쉽게 할 수 있는 조치 및 방법에 관한 사항
- 5.전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하는 자는 다음 각 호의 어느 하나에 해당하는 행위를 하여서는 아니 된다. <개정 2024. 1. 23.>
- ①광고성 정보 수신자의 수신거부 또는 수신동의의 철회를 회피ㆍ방해하는 행위
- ②숫자ㆍ부호 또는 문자를 조합하여 전화번호ㆍ전자우편주소 등 수신자의 연락처를 자동으로 만들어 내는 행위
- ③영리목적의 광고성 정보를 전송할 목적으로 전화번호 또는 전자우편주소를 자동으로 등록하는 행위
- ④광고성 정보 전송자의 신원이나 광고 전송 출처를 감추기 위한 각종 행위
- ⑤영리목적의 광고성 정보를 전송할 목적으로 수신자를 기망하여 회신을 유도하는 각종 행위
- 6.전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하는 자는 수신자가 수신거부나 수신동의의 철회를 할 때 발생하는 전화요금 등의 금전적 비용을 수신자가 부담하지 아니하도록 대통령령으로 정하는 바에 따라 필요한 조치를 하여야 한다.
- 7.전자적 전송매체를 이용하여 영리목적의 광고성 정보를 전송하려는 자는 수신자가 제1항 및 제3항에 따른 수신동의, 제2항에 따른 수신거부 또는 수신동의 철회에 관한 의사를 표시할 때에는 해당 수신자에게 대통령령으로 정하는 바에 따라 수신동의, 수신거부 또는 수신동의 철회에 대한 처리 결과를 알려야 한다. <개정 2024. 1. 23.>
- 8.제1항 또는 제3항에 따라 수신동의를 받은 자는 대통령령으로 정하는 바에 따라 정기적으로 광고성 정보 수신자의 수신동의 여부를 확인하여야 한다.
제 74조 (벌칙)
- 1.다음 각 호의 어느 하나에 해당하는 자는 1년 이하의 징역 또는 1천만원 이하의 벌금에 처한다. <개정 2012. 2. 17., 2014. 5. 28.>
- ①제8조제4항을 위반하여 비슷한 표시를 한 제품을 표시ㆍ판매 또는 판매할 목적으로 진열한 자
- ②제44조의7제1항제1호를 위반하여 음란한 부호ㆍ문언ㆍ음향ㆍ화상 또는 영상을 배포ㆍ판매ㆍ임대하거나 공공연하게 전시한 자
- ③제44조의7제1항제3호를 위반하여 공포심이나 불안감을 유발하는 부호ㆍ문언ㆍ음향ㆍ화상 또는 영상을 반복적으로 상대방에게 도달하게 한 자
- ④제50조제5항을 위반하여 조치를 한 자
- ⑤삭제 <2014. 5. 28.>
- ⑥삭제 <2024. 1. 23.>
- ⑦제53조제4항을 위반하여 등록사항의 변경등록 또는 사업의 양도ㆍ양수 또는 합병ㆍ상속의 신고를 하지 아니한 자
- 2.제1항제3호의 죄는 피해자가 구체적으로 밝힌 의사에 반하여 공소를 제기할 수 없다.