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Hydroxychloroquine 역상분석의 메서드 최적화사례 -휘발성 이동상 조건의 고속 분석
Hydroxychloroquine 역상분석의 메서드 최적화사례
ー휘발성 이동상 조건의 고속 분석ー
하이드록시클로로퀸은 1955년에 미국에서 승인돼 현재 전 세계 70개국 이상에서 말라리아, 전신성 에리테마토데스,피부홍반성낭창을 비롯한 다양한 병태에 이용되고 있습니다.일본에서는 승인되지 않았었지만 2014년 8월 8일 제조 판매 승인이 이루어졌습니다.
하이드록시클로로퀸의 분석 방법으로는 USP(The United States Pharmacopeia;미국약전)의
"Hydroxychloroquine Sulfate Tablets"Assay항에서 HPLC법이 규정되어 있습니다.이 USP분석 조건에서는
이동상에 비휘발성 이온 페어링 시약이 사용되고 있어 LC-MS(MS)에 적용할 수 없습니다.
그래서 이번에 유기 하이브리드 실리카 컬럼 Triart C18과 LC-MS(MS)에 적응 가능한 휘발성 이동상을 이용해,
하이드록시클로로퀸 및 클로로퀸 혼합물의 분리 메서드 최적화 및 고속화 적용 사례를 소개합니다.
우선 적합한 용매 조건을 스크리닝하기 위해 먼저 pH조건과 용매조건을 달리하여 시험을 진행했습니다. 이 때 사용한 컬럼은 Triart C18컬럼으로 사용가능한 pH 영역이 1~12로 넓고 머무름 정도가 가장 노멀하기 때문에 First Choice컬럼으로 적당한 컬럼입니다. YMC의 C18컬럼의 특징은 이전에 소개드린 YMC C18컬럼 포스트를 참고하세요.
스크리닝한 결과는 다음과 같은 그림으로 나타낼 수 있습니다.
크로마토그램을 보시면 pH 6.1과 pH 9.9에서 시험한 결과는 피크 모양이 나쁘게 나온 것을 확인할 수 있습니다. 이는 각 물질의 pKa부근이기 때문으로 보입니다. 산성조건에서는 pH 2.9보다 pH 4.3이 분리능이 더 좋게 나오는 것을 확인할 수 있습니다. 따라서 시험의 진행은 pH 4.3에서 실시합니다. 상기 물질 뿐만 아니라 다른 물질의 분석이라도 같은 방법으로 최적조건을 스크리닝 할 수 있습니다.
스크리닝 결과에서 Gradient조건을 살펴보면 피크가 용출되는 농도가 Acetonitrile에서 25%, Methanol에서 36%인 것을 확인할 수 있습니다. 이를 빠른 분석을 위해 isocratic조건으로 변경을 진행합니다.
Gradient조건에서 isocratic으로 전환할 때는 유기용매 농도를 15%에서 20%정도 낮추어서 진행합니다.
데이터에서 볼 수 있듯이 Methanol조건에 비해 Acetonitrile조건이 분석 시간도 빠르고 분리도 양호하게 나오는 것을 확인할 수 있습니다. (Acetonitrile분석시간 : 8분, Methanol분석시간 12분, Acetonitrile 분리도 : 5.7, Methanol 분리도 :4.4)
이를 바탕으로 분석을 고속화하기 위해 동일 조건에서 유속을 높여 분석시간을 줄여보았습니다. 수행은 UHPLC(UPLC)에서 진행합니다. UHPLC는 고압을 견딜 수 있기 때문에 Particle size가 매우 작은 컬럼의 사용이 가능하고 넓은 영역의 최적 선속도를 보장합니다. Triart C18의 UHPLC용 컬럼은 최대 내압 100MPa(14,500psi)을 보장합니다.
크로마토그램의 결과를 살펴보면 1.0mL/min의 유속에서도 분리도를 유지함을 확인할 수 있습니다.
USP메서드와 비교해보면 위 그림과 같이 분석시간에서 고속화가 이루어졌음을 볼 수 있습니다. 분석시간이 단축되면 이동상의 사용량이 줄어들기 때문에 유지비 측면에서 cost down을 가져올 수 있습니다. 특히 위 방법의 경우에는 USP메서드가 비휘발성 이온페어링 시약을 사용하기 때문에 MS의 사용이 어려운 조건입니다. YMC의 메서드를 적용할 경우 이동상이 휘발성이기 때문에 MS(또는 MSMS)의 사용이 가능하게 됩니다.
본 포스트에서는 하이드록시클로로퀸의 고속분석을 위한 메서드 최적화를 진행하였습니다. 위의 과정은 고속분석을 위한 메서드 변환과정에서 동일하게 진행하실 수 있습니다.
=관련 문의=
YMC 분석지원실
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